05 Июл

Репродукция метапневмовируса в клеточных культурах

Способность вирусов, наряду с репликацией инициировать цитопатогенное действие в чувствительных клетках является их генетическим маркером.
Первичное выделение метапневмовирусов (МПВ) птиц проводили в культуре фибробластов куриных эмбрионов [9] с последующей адаптацией в клетках Vero и QT [5]. Вирус индуцировал характерные синцитии.

Аттенуированные вакцины против метапневмовирусной инфекции, вызванной МПВ птиц подгруппы C, были получены в клеточных культурах [11,12]. Возможность культивирования вакцинных штаммов P 63-APV и ca-APV в различных перевиваемых линиях клеток (Vero, BGM, MA-104, BНK-21, McCoy, DF-1, QT-35, TEF) сообщали Patnayak et al. (2005) [13].

А.Б. Сарбасов с соавт. (2003) [2]; И. А. Борисова (2008) [1] культивировали МПВ птиц для наработки вирусной биомассы в клетках Vero при изготовлении инактивированной вакцины против метапневмовирусной инфекции птиц. Вирус накапливался в титрах 6.0-6.5lg ТЦД 50/см³.
Антигены для ELISA могут быть приготовлены на различных системах, включающих ФЭК [6,10] или клетки Vero [8]. Очевидно, что получение высокоактивного антигена метапневмовируса для иммуноферментного анализа зависит от выбора биологической модели для его культивирования [4].

Цель и задачи иследований
Целью наших исследований явилось изучение процессов репликации вакцинных штаммов метапневмовируса птиц в различных клеточных системах.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Изучить процесс репликации вируса в первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов.
Изучить процесс репликации вируса в клетках Vero.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали эталонные производственные вакцинные штаммы 8544 [16] подтипа А и VC-03 [14] подтипа В, реизолированные из лиофилизированных препаратов производства фирм Intervet и Rhone Merilux.

Культуры клеток:

Первично-трипсинизированная культура клеток куриных эмбрионов (ФЭК);
Перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки (клетки Vero), институт гриппа, Санкт-Петербург.
Инкубационные яйца СПФ-кур фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия).
Питательные среды, сыворотки и растворы:
Питательная среда Игла МЕМ или ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином;
Питательная среда №199, жидкая, с L-глутамином;
Питательная среда ДМЕМ/F12 с Hepes, жидкая;
Сыворотка крови крупного рогатого скота, не консервированная для культур клеток (КРС);
Сыворотка крови плодов коровы;
Трипсина раствор 0,25% фирмы «US BIO»;
Версена раствор 0,02%;
Хенкса раствор фирмы «Hyclone».
Питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы «Hyclone», производство ООО «Биолот»;
Первично-трипсинизированную культуру клеток (ФЭК) готовили по методу Dulbecco a. Vogt (1954) [7] в модификации Youngner (1954) [17]. Культуру выращивали в стационарных условиях в течение 2-3 суток до формирования ровного плотного монослоя в ростовой среде Игла МЕМ и №199 в соотношении 2:1 с содержанием до 10% сыворотки крови КРС, а клетки Vero – в среде ДМЕМ/F12 и 10% сыворотки крови плодов коровы.
Перед заражением пробирочные культуры клеток освобождали от ростовой среды, отмывали поддерживающей средой, вносили вируссодержащий материал в дозе 0,1-1,0 ЦПД50 на клетку и оставляли культуру при (37,5±0,5)°C в течение 30-60 минут для адсорбции вируса. Затем добавляли поддерживающую среду без сыворотки крови.

Инфицированные культуры инкубировали в течение 4-6 суток при температуре 37,5°C до появления выраженного цитопатогенного действия вируса. Вируссодержащую суспензию замораживали, оттаивали и объединяли в общую пробу. Инфекционную активность штаммов вируса определяли в культуре клеток по Reed a. Muench (1938) [15].

Специфичность действия вируса на клетки подтверждали в реакции нейтрализации (3. Лярски, 1980) [3].

Результаты исследований
При микроскопическом изучении неокрашенных клеточных культур, зараженных вакцинными штаммами МПВП, отмечали характерные цитопатические изменения, которые выражались в дегенерациях клеток через различные сроки после инокуляции. Использованные штаммы вируса адаптировались к условиям культивирования в культурах клеток ФЭК и клетках Vero с первого пассажа.
Вакцинные штаммы вируса вызывали фокусные изменения клеточного монослоя в виде округления клеток и появления в них зернистости через 48-72 ч. после инфицированния клеток Vero и ФЭК. В процессе инкубации интенсивность цитопатогеннного действия вируса на клетки повышалась.
Цитопатические изменения были характерны для острой формы инфекции и выражались в дегенеративных изменениях в клетках, образовании синцитий и гибели клеток монослоя.

Данные определения инфекционного титра штаммов в процессе 10 пассажей представлены в таблице.

В результате проведенных исследований установлено, что метапневмовирус накапливался в высоких титрах в перевиваемой линии клеток Vero и ниже в первично-трипсинизированной культуре ФЭК, причем в более высоких титрах накапливался штамм VC-03, чем штамм 8544. Чувствительность клеточных культур к вакцинному штамму VC-03 МПВ птиц была выше, по сравнению со штаммом 8544.
Полученные нами результаты исследования подтверждают данные ряда ученых [1,5,13] установивших, что чувствительными клеточными культурами к МПВ птиц являются первично-трипсинизированная культура ФЭК и перевиваемая линия клеток Vero.

Выводы и рекомендации
Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц вызывают острую форму инфекции в испытуемых клеточных культурах, обуславливая дегенерацию и гибель клеток, образование синцитий. Установлены различия штаммов вируса в биологической активности в зависимости от вида культуры клеток.
Полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что для наработки вируссодержащего материала МПВ птиц для ИФА можно использовать обе биологические системы, но предпочтительнее использовать перевиваемую линию клеток Vero.

Список литературы
Борисова И.А. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против Ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц //Борисова И.А./ Автореф. дис.канд.биол.наук. – Владимир.-2008-25 С.
Сарбасов А.Б. Изучение антигенных свойств пневмовируса птиц на цыплятах //Сарбасов А.Б., Старсов С.К., Борисов А.В. [и др.]/ Актуал. пробл. информ. патологии животных – Владимир-2003.-с.354-356.
Лярски З. Диагностика вирусных болезней животных //Лярски З./ Под редакцией В.Н. Сюрина. – М.: Колос, 1980.-400С.
Никитина Н.В. Получение антигена пневмовируса птиц для иммуноферментного анализа //Н.В.Никитина, Б.Б.Трефилов, Д.В.Дмитриев[и др.]/ Новое в диагностике и профилактике болезней птиц (матер. научно-практ.конф. 3-4 июня 2008г.).- СПб. – 2008. – С. 94-97.
Chiang S.J. Isolation of avian pneumovirus in QT-35cells//Chiand S.J., Dar A.M ,Goyal S.M. et al./ Vet. Rec. – 1998. – 143.- P. 596.
Chette N.J., Turkey rhinotracheitis: detection of antibodies using an ELISA test / N.J. Chette, P.J. Wyeth // British Veterinary Journal. -1988.- 144, 282-287.
Dulbecco R. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses //Dulbecco R., Vogt M.J./-J.exp.Med.-1954.-v.99.- no2. – pp. 167-182.
Giraud P. Turkey rhinotracheitis in France preliminary investigations on a ciliostatic virus // P. Giraud, G. Beiwejean, M. Guittet et al.// Vet. Rec. – 1986. – V. 119. – P. 606-607.
Goyal S.M. Isolation of avian pneumovirus from on outbreak of respiratory illness in Minnesota turkeys //Goyal S.M,Chiang S.J.,Dar A.M. et al./J. of Vet. Diagn. Invest.-2000.-12.-p.p. 166-168.
Grant M. An enzyme – linked immunosorbent assay for the serodiagnosis of turkey rhinotracheitis infection / M. Grant, C. Baxter-Jones, G.P. Wilding// Vet. Rec. – 1987. – V. 120. – P. 279 – 280.
Patnayak D.P. Experimental and field evaluation of a live vaccine against avian pneumovirus //Patnayak D.P., Sheikh M.A., Gulati B.R. et al./Av. Pathol.-2002.-31.-p.p.377-382.
Patnayak D.P. Gold adapted avian pnevmovirus for use as live, attenuated vaccine in turkeys //Patnayak D.P., Gulati B.R., Sheikh M.A., et al./ Vaccine. – 2003.-21.-p.p-1371-1374.
Patnayak D.P.Growth of vaccine strains of avian pneumovirus in different cell lines. //Patnayak D.P, Tivari A., Goyal S.M./ Av. Path.-2005.-34(2).-p.p.123-126.
Picault J.P. Isolation of a T.R.T.V.-live virus from chickens with swollen-head syndrome//Picault J.P., Giraud P., Drouin P. et al. / Vet. Rec.-1987.-121-p.135.
Reed L.J. A simple method of estimating fifty percent endpoints //Reed L.J., Muench H./ Amer.J.of Hyg-1938.-V.27.-p.p.493-497.
Wilding G.P. Ciliostatic agent found in rhinotracheitis//Wilding G.P., Jones C.S., Grant M./ Vet.Rec.-1986.-118.p.735.
Youngner J.S. Monolayer tissue cultures: 1. Preparation and standartization of suspenstions of trypsin-dispersed monrey kidney cells //Youngner J.S./ Proc.Soc.Exp.Biol.a.Med(N.J.).-1954.-V.85.-no2.-p.202.

Оставить комментарий